免疫组化抗体技术指南：如何选择、验证抗体并排除染色故障——病理诊断与科研研究的实用手册

免疫组化（IHC）技术通过抗原-抗体特异性结合，利用标记的二抗对组织中的特定抗原进行定位和定量分析，是病理诊断和科研研究的重要工具。然而，抗体的选择、验证及染色故障的排除直接影响实验结果的准确性和可靠性。本文将从抗体选择、验证及染色故障排除三个方面进行系统阐述。

免疫组化抗体的选择、验证与对照设置

成功的IHC实验始于抗体的谨慎选择与严格验证。由于不同抗体克隆针对同一靶蛋白的不同表位，且其性能在不同实验方法（如Western Blot与IHC）间可能存在显著差异，因此选择时必须考虑其已验证的应用场景，明确实验目的与抗原特性。

样本类型确定：石蜡包埋（FFPE）vs 冰冻切片

样本的处理方式直接影响抗体的表现和实验方案的制定。石蜡切片需选择经过抗原修复验证的抗体，而冰冻切片抗体可能不适用于石蜡样本。

● 观察实验样本的类型

明确是经过福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的组织切片，还是新鲜取材后直接冷冻保存的切片。两种样本的抗原保存状态不同：FFPE样本因固定和脱水过程可能导致部分抗原表位被掩盖，需通过抗原修复（如热修复或酶修复）暴露；冷冻样本抗原结构更接近原始状态，但可能因冰晶形成导致组织形态受损。

● 样本预处理

若为FFPE样本，需进行脱蜡（二_甲_苯_浸泡）和水化（梯度酒精至蒸馏水），随后进行抗原修复（如柠檬酸缓冲液煮沸或高压修复）。

若为冷冻样本，直接从-80℃取出后平衡至室温，用丙酮或甲醇固定（避免福尔马林固定导致抗原交联）。

● 记录样本状态

观察切片厚度（通常FFPE为4-5μm，冷冻为8-10μm）、组织完整性及背景颜色，为后续结果分析提供依据。

根据样本类型选择抗体。例如，FFPE样本需优先选择经过验证的"石蜡适用"抗体（通常标注为"for IHC-P"），而冷冻样本可选择"冰冻适用"或"多用途"抗体。若抗体说明书未明确说明，需通过预实验验证其兼容性。

预期染色模式与对照设置

● 明确抗体在目标组织中的预期染色模式

错误的定位（例如本应膜表达的蛋白出现核染色）可能提示非特异性结合。

细胞类型：如上皮细胞、淋巴细胞、肿瘤细胞等。

亚细胞定位：细胞核（如Ki-67）、细胞质（如β-catenin）、细胞膜（如PD-L1）或细胞外基质（如胶原蛋白）。

● 设置对照

阳性对照：选择已知表达目标蛋白的组织（如乳腺癌组织中的ER/PR，或正常肾脏组织中的AQP2）作为阳性对照，验证抗体有效性。

阴性对照：使用同型IgG（非免疫血清）或省略一抗，确认非特异性结合（如背景着色或假阳性）。

● 根据预期模式调整实验条件

例如，若目标蛋白位于细胞核，需确保抗原修复充分（如高压修复比热修复更有效）；若为膜蛋白，需避免过度固定导致膜结构破坏。若预期结果与文献不符，需排查抗体浓度、修复条件或样本质量问题。

种属反应性与实验背景

● 种属反应性是抗体选择的基础

首先，确保抗体能识别目标蛋白所属的种属（如人、小鼠、大鼠）。其次，在免疫组化中，还需考虑一抗与样本种属的匹配，以避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应。因此应首先确认抗体说明书中的“种属反应性”（Species Reactivity），即抗体能否识别实验样本的种属来源（如人、小鼠、大鼠等）。同时需考虑应用类型和具体需求。

应用类型：免疫组化（IHC）、免疫荧光（IF）或流式细胞术（FC）。不同应用需不同抗体克隆号（如IHC专用抗体可能经过交联修饰）。

多重染色需求：若需同时检测多个蛋白，需选择不同种属来源的抗体（如一抗来自兔，二抗标记抗兔IgG；另一一抗来自小鼠，二抗标记抗小鼠IgG），避免交叉反应。

● 验证抗体交叉反应

若实验样本为转基因小鼠（表达人源蛋白），需确认抗体是否同时识别小鼠和人源抗原（如“Cross-reacts with human and mouse”）。

若样本为非标准种属（如斑马鱼），需通过Western blot预实验验证抗体特异性。

优化抗体浓度：

进行梯度稀释（如1:50、1:100、1:200），通过预实验确定最佳浓度（背景低且信号强）。

● 正式开展实验

按优化条件处理样本（修复、封闭、孵育一抗/二抗）。

显色后观察结果，对比预期模式与实际染色（如定位是否一致、强度是否合理）。

若结果异常，回顾前三步（样本类型、预期模式、种属反应性）并调整参数（如更换抗体、调整修复时间或浓度）。

免疫组化中单克隆与多克隆抗体的选择（快速比较）

单克隆抗体与多克隆抗体各有优劣，选择取决于实验的具体需求。

若需高特异性定位（如PD-L1在肿瘤细胞膜的表达），优先选择单克隆抗体。

若需高敏感性检测（如炎症因子在石蜡组织中的弱表达），可尝试多克隆抗体，但需严格验证特异性（如通过吸收实验排除非特异性结合）。

好的IHC验证证据应包含哪些内容

● 特异性验证

吸收实验（Competition/Spike-in实验）：使用过量的目标抗原与抗体预孵育，若后续染色信号明显减弱或消失，可证明抗体与目标蛋白的结合具有特异性。

基因敲除/沉默对照：在目标基因敲除（KO）或敲低（如siRNA处理）的细胞或组织样本中，应基本无染色信号，作为阴性对照的重要依据。

● 敏感性验证

梯度稀释测试：通过系列稀释确定抗体的最佳工作浓度，例如1:100稀释下仍能清晰染色，而1:200时信号明显减弱，有助于明确检测下限。

低丰度蛋白检测：在已知低表达目标蛋白的组织（如某些正常组织）与高表达组织（如对应肿瘤）中进行染色比较，验证抗体是否能稳定检测出低水平表达。

● 种属交叉反应验证

若抗体说明书注明可应用于多种属（如“人/小鼠通用”），应在不同种属的组织中分别验证，确保染色模式一致，避免交叉反应差异导致的假象。

● 应用类型验证

确认抗体明确标注适用于IHC实验，并建议参考已发表的IHC染色图像（如产品说明书或相关文献中的典型结果），作为预期染色模式的依据。

● 批次间一致性验证

尤其是多克隆抗体，不同批次间可能存在差异。建议对不同批次的抗体进行平行染色实验，确保染色强度与模式无明显差异。

所有验证实验应保存完整的图像与数据记录，整理成验证报告，例如包含吸收实验阴性对照图、基因敲除样本无染色结果等，作为实验可重复性的支持材料。

若验证过程中发现非特异性染色强、信号弱或无信号等问题，可能需考虑更换抗体或进一步优化实验条件，如调整抗原修复方法、降低抗体浓度等。

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基本优化方案（稀释度 + 抗原修复）

在免疫组化实验中，通过有限次的系统化测试快速确定最佳工作条件，既能保证染色质量，又能节省时间与试剂。

● 抗体稀释度优化

首先固定抗原修复条件（例如采用柠檬酸缓冲液进行高压修复10分钟），然后进行以下步骤。

选择3–5个稀释度（如1:50、1:100、1:200、1:400），对同一批组织样本进行平行染色。对比观察染色结果。

最佳稀释度：信号清晰且非特异性背景最低（例如在1:200时肿瘤细胞核强阳性，周围间质无着色）。

需排除的稀释度：浓度过高（如1:50）易导致背景过深；浓度过低（如1:400）则信号微弱，均不适用于正式实验。

● 抗原修复条件优化

在确定抗体最佳稀释度的基础上，进一步优化抗原修复方法。

固定抗体稀释度（例如1:200）

比较2–3种常用修复方法：

热修复：柠檬酸缓冲液适用于多数核抗原（如Ki-67）；EDTA缓冲液更适合膜蛋白或某些难以暴露的抗原（如EGFR）。

酶修复：如蛋白酶K或胰蛋白酶，一般仅用于福尔马林固定后抗原严重遮蔽的情况，使用时需严格控制时间，以防组织损伤。

根据目标蛋白的定位与染色清晰度，选择信噪比最高的修复方案。

● 优化结果的记录与后续步骤

将最终确定的条件（例如“抗体稀释度1:200 + 柠檬酸缓冲液高压修复10分钟”）列入实验操作流程，作为后续实验的统一标准。若优化后染色效果仍不理想，可进一步检查其他可能影响的环节，如封闭时间、二抗浓度或显色系统等，逐步完善实验体系。

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