ELISA系列|酶联免疫吸附试验（ELISA）原理、数据分析及常见问题解析
966 人阅读发布时间：2025-05-09 18:12
酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种基于抗原-抗体特异性结合的高灵敏度免疫学检测技术。其核心原理是将抗原或抗体的免疫学活性与酶催化底物显色的高效性相结合，通过颜色反应的强弱判断待测物浓度。
酶标记物：如辣根过氧化物酶（HRP），催化底物显色。
① 包被：将抗原或抗体通过物理吸附固定于固相载体，保持其免疫活性；
② 结合：加入待测样本及酶标抗原/抗体，形成复合物；
③ 显色：加入底物（如TMB），酶催化反应生成有色产物；
④ 定量/定性分析：通过光密度（OD值）计算浓度或判断阴阳性。
根据检测目标及实验设计差异，ELISA可分为以下四类：
双抗夹心法（三明治法）：适用于大分子蛋白（如细胞因子、病毒抗原）。
流程：包被抗体→加入待测抗原→加入酶标抗体→显色。
图：双抗夹心ELISA：微孔板包被特异性抗体，加入待测蛋白，再加入酶标抗体，形成夹心复合物
竞争法：用于小分子（激素、药物）。包被抗体后，待测抗原与酶标抗原竞争结合抗体，显色强度与待测物浓度负相关。
流程：包被抗体 →同时加入待测抗原和酶标抗原（竞争结合） → 洗涤 → 显色 → 终止反应。
流程：包被抗人IgM→捕获血清IgM→加入特异性抗原→酶标抗体显色。
定量ELISA的核心是通过标准曲线将样本OD值转换为浓度。常用软件CurveExpert 1.4进行曲线拟合。
进入官网 www.cusabio.cn/ 在技术信息栏点击操作视及标曲绘制（软件下载）进入“Curve Expert1.4”软件下载页面
① 输入数据：将标准品浓度及对应OD值粘贴至软件；
② 自动拟合：点击“运行”，软件筛选最优模型（R²≥0.99）；
③ 选择模型：优先选择拟合度高、无拐点的曲线（如四参数逻辑回归）；
④ 导出方程：复制公式至Excel，利用函数批量计算样本浓度；
| 参数 |
双抗夹心法 |
竞争法 |
| 相关性 |
正相关（OD↑浓度↑） |
负相关（OD↓浓度↑） |
| 适用对象 |
大分子蛋白质 |
小分子（<10 kDa） |
| 曲线形状 |
S型 |
反S型 |
| 数据处理要点 |
低浓度区灵敏度高 |
高浓度区精度更优 |
定性ELISA用于判断样本的阴阳性，无需计算具体浓度，关键步骤为确定截断值（Cut off值）。
公式：Cut off = 2.1 × 阴性质控OD均值
示例：若阴性质控OD均值为（0.1442+0.1308）/2=0.1375，则Cut off=0.28875。
判定标准：样本OD≥Cut off为阳性，反之为阴性。
解决：逐一取消勾选模型选项（如多项式），或联系技术支持。
低数据量警告：标准品点数不足时，多项式拟合可能报错。
调整方法：减少多项式次数或改用其他模型（如线性回归）。
科学计数法问题：公式中“E”表示科学计数（如1.5E-5=1.5×10⁻⁵）。
解读：高阶多项式公式简写（如四次多项式：y=a+bx+cx²+dx³+ex⁴）。
医学诊断：传染病抗体检测（如HIV、HBV）、肿瘤标志物筛查（华美生物产品仅用于科研）；
随着自动化设备和多重检测技术的发展，ELISA正朝着高通量、微型化方向演进。结合人工智能的数据分析算法，未来将进一步提升检测效率和准确性，为精准医疗和即时检测（POCT）提供更优解决方案。
掌握ELISA技术原理及数据分析方法，是确保实验结果可靠的关键。通过合理选择实验方案、规范操作流程，并结合软件工具优化标曲拟合，可显著提升检测质量。对于疑难问题，需结合理论分析与实践经验，逐步排查并优化实验设计。 
