ELISA系列|常见样本处理与检测 ——ELISA 实验中的关键要点
198 人阅读发布时间：2025-04-25 13:30
ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种基于免疫学反应的高灵敏度试验技术，它将抗原与抗体的特异性结合和酶对底物的高效催化作用巧妙融合，能够对样本中的特定物质进行精准的定量或定性检测。自 20 世纪 60 - 70 年代问世以来，以其操作简便、设备要求不高以及可实现高通量检测等诸多优点，在生物医学研究、临床诊断等诸多领域得到了广泛的应用。
在 ELISA 实验全流程里，样本处理堪称是确保实验结果可信度的 “奠基石”。倘若样本处理环节出现问题，后续的检测结果便很可能会出现偏差。
假阳性结果：一方面，若样本在采集、处理或储存过程中遭受细菌、病毒或化学物质等外源性污染，这些 “不速之客” 可能与试剂发生非特异性反应，进而被检测系统误判为待测物信号，导致假阳性结果产生；另一方面，样本内若存在能与抗体非特异性结合的成分，像纤维蛋白原、免疫球蛋白等，它们会干扰抗体与目标抗原的精准识别与结合，同样造成假阳性结果。
假阴性结果：其一，样本处理时若出现不当稀释情况，使得目标分析物浓度被稀释至检测方法的下限之下，仪器便无法准确 “捕捉” 到其存在，从而得出假阴性结果；其二，样本在采集、储存及处理阶段，目标分析物若因物理、化学或生物等因素发生降解，浓度降低后也会引发假阴性结果；再者，样本中存在与目标分析物结构相似的干扰物质，它们会与抗体竞争性结合，抢占了目标分析物与抗体结合的 “机会”，致使检测信号减弱甚至消失，产生假阴性结果。
实验误差增加：不同实验批次、不同实验员在处理样本时，手法、操作强度、时间把控等若存在差异，就会导致样本处理不一致，为实验结果引入额外的随机误差；此外，像离心机、移液器这类实验常用设备，若未定期校准、维护，出现性能不稳定、读数不准等情况，也会直接影响样本处理过程中的精准度，进一步增加实验误差。
规范、正确的样本处理能够确保实验结果的准确性，极大程度减少假阳性和假阴性结果的干扰，让检测数据真实反映样本中目标物质的实际含量；还能提升实验的可重复性，即便由不同批次实验或不同实验员操作，只要遵循统一的样本处理标准，就能保证结果的稳定性与可比性；并且，高质量的样本处理可以增强实验结果的可信度，为基于这些结果开展的临床诊断、药物研发决策等提供坚实可靠的依据。
血清 / 血浆：它们富含多种生物标志物，例如抗体、抗原、细胞因子等，在免疫学研究领域应用广泛。处理这类样本时要注意避免纤维蛋白原、血脂等成分的干扰，同时严格把控采集时间和储存条件。
组织样本：包含细胞、细胞外基质以及各类生物分子（DNA、RNA、蛋白质等），是蛋白质组学研究、疾病发生机制探究等不可或缺的样本类型。关键是要防止组织降解，确保选取合适的组织类型和部位。
细胞培养上清：主要含有细胞分泌的蛋白质，对于细胞生物学研究具有重要价值。处理时需去除细胞碎片和死细胞，以免干扰对目标分泌蛋白的检测。
尿液：采集方便，且含有丰富代谢物和生物标志物，可用于评估机体代谢状态、肾脏功能等。但因其易受外界污染，所以在收集、处理过程中要注意保持无菌操作。
其他体液：唾液含有 DNA、抗体、细胞因子等，可用于免疫学研究；脑脊液能反映中枢神经系统状态；胸腔积液、腹水则可用于分析胸腔和腹腔相关疾病情况，针对这些特殊体液，要依据其独特性质选择恰当的采集和处理方式。
| 血清血浆 |
| 血清 |
自然凝固或促凝剂 |
|
| 血浆 |
枸橼酸钠（柠檬酸钠） |
血液中溶解度低，抗凝作用较弱 |
| 乙_二_胺_四乙酸（EDTA） |
对红细胞和白细胞形态影响小 |
| 肝素 |
抗凝能力强、不影响血细胞体积、不易溶血、能耐高温。 |
血清样本处理：采集全血后不加抗凝剂，可置于室温让其自然凝固，也可 4°C 过夜，之后在 2 - 8°C 环境下以 1000xg 离心 15 分钟，取上清即为血清，可立即用于检测，或进行分装后存放于 -20°C 或 -80°C，但要避免反复冻融，若样本解冻后还需再次离心，去除可能产生的沉淀杂质后再检测。
血浆样本处理：全血采集后需及时加入抗凝剂（EDTA 或肝素），在 30 分钟内于 2 - 8°C、1000xg 离心 15 分钟，分离出的上清即血浆，后续操作同血清样本。
组织裂解液制备：取 100mg 组织，先用 1XPBS 洗去血污，剪成小块放入匀浆管，加入 1ml 1XPBS 制成匀浆，置于 -20°C 过夜，反复冻融 2 次破坏细胞膜后，在 2 - 8°C、5000xg 离心 5 分钟取上清，可用于实验或分装冻存。
细胞裂解液制备：对于贴壁细胞，先将培养瓶置于冰上，吸出培养液，用冷 PBS 充分洗涤细胞表面去除残留培养基，倒掉 PBS 后转移细胞至离心管，用 1xPBS 稀释至浓度 100million/ml，置于 -20°C 过夜冻融 2 轮破坏细胞膜，再在 2 - 8°C、5000xg 离心 5 分钟取上清；悬浮细胞则是收集细胞至离心管，2 - 8°C、1000xg 离心 5 分钟去除上清，用 1xPBS 轻柔重悬后再次离心，稀释至合适浓度后冻融处理，后续步骤同贴壁细胞。
细胞培养上清处理：收集上清后在 2 - 8°C、1000xg 离心 15 分钟去除杂质，上清可直接用于实验或分装冻存。
唾液样本处理：收集唾液后，如有残渣或沉淀，可在 2 - 8°C、4000xg 离心 10 分钟，取上清用于实验或分装后存放，建议优先使用新鲜样本。
尿液样本处理：用无菌管收集尿液后，在 2 - 8°C、1000xg 离心 15 分钟取上清，之后可立即检测或分装保存，同样要注意避免反复冻融，且在试验前再次离心去除可能新产生的沉淀。
蛋白酶抑制剂使用 ：适量添加蛋白酶抑制剂能有效抑制蛋白酶活性，防止目的蛋白降解，但要按推荐剂量使用，并做好个人防护。
抗凝剂选择 ：不同抗凝剂特性各异，科研人员需依据具体研究目的和样本类型合理挑选。
蛋白酶 K 与胰酶消化 ：蛋白酶 K 可降解蛋白质，但其作用效果受多因素影响；胰酶消化贴壁细胞时，需精准把控条件，防止过消化损伤细胞，且消化后要充分洗涤细胞去除残留胰酶。
样本储存与运输 ：根据样本类型和实验需求，科学选择储存温度；分装样本时要预留一定膨胀空间，使用具温度显示与报警功能的设备储存，定期检查设备性能；运输时要选用耐低温、密封性好的材料，合理确定容器尺寸，确保保温性能，规范标记样本信息等关键内容，监控运输温度，必要时选择专业温控物流服务。
样本稀释：依据实验需求进行不同倍数稀释，不同稀释倍数对检测结果影响显著，原液检测可能因浓度过高出现 “带现象”，而随着合适稀释后，OD 值会逐渐降低并趋于稳定。
样本检测实例与冻融影响：以不同 ELISA 试剂盒检测血清、血浆、组织等样本为例，能发现同一指标在血清、血浆以及冻融处理后的测值存在一定差异；不同组织检测同一指标或同一组织检测不同指标，测值也各有不同，所以在开展 ELISA 检测时，要充分考虑这些因素，尽量保持样本处理条件的一致性，必要时通过预实验摸索最佳检测条件。
综上所述，在 ELISA 实验中，样本处理的每一步都至关重要，从样本采集、处理到保存、运输以及后续的检测，每一个环节都需要严谨操作、精细把控，才能为获取高质量的实验结果奠定坚实基础。 
