ELISA系列：ELISA原理与操作要点
631 人阅读发布时间：2025-04-18 10:53
酶联免疫吸附测定（ELISA）作为生物医学研究的基石技术，凭借其高灵敏度、强特异性和灵活的应用场景，已成为分子检测领域的黄金标准。从基础科研到临床诊断，ELISA技术持续推动着生命科学的发展。
酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种将抗原-抗体特异性反应与酶催化底物显色相结合的高灵敏度检测技术。其核心原理是通过固相载体（如96孔板）固定抗原或抗体，利用酶标记的二抗或抗原与待测物结合，最终通过显色反应定量分析目标物质。
根据检测对象和反应模式，ELISA主要分为以下类型：
| 方法 |
原理 |
适用于 |
优点 |
缺点 |
| 夹心ELISA |
双抗体 |
抗体结合到微孔板上，随后加入标记抗体进行检测 |
检测抗原最常用的方法，适用于检验各种蛋白质等大分子抗原 |
特异性高、灵敏度高、重复性好 |
不能检测小分子抗原及半抗原 |
| 双抗原 |
抗原结合到微孔板上，随后加入标记抗原进行检测 |
乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法 |
标本不需稀释，可直接测定，敏感度相对高于间接法 |
酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。 |
| 间接法测抗体 |
抗原首先固定到微孔板上，检测抗体与抗原，再加入酶标二抗 |
是检测抗体最常用的方法, 主要用于对病原体抗体的检测 |
只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体 |
对抗原的纯度要求高 |
| 竞争法测抗原 |
样品中的抗原或抗体竞争性的结合特定酶标抗体或抗原 |
小分子抗原如激素和药物等 |
步骤简单快捷 |
适用性有限，操作要求 |
| 直接ELISA |
抗原固定于微孔板上，用酶标抗体直检测抗原 |
评估亲和力、特异性 |
实验步骤少，检测速度快 |
背景较高，灵敏度不高，成本高 |
| 捕获包被法测抗体 |
主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定 |
检测特异性IgM |
针对性强，避免IgG干扰 |
适用性相对有限 |
➤ 试剂平衡：所有组分需提前30-60分钟室温平衡，消除温度梯度对反应动力学的影响。
冻干标准品需用指定稀释液充分溶解，静置15分钟后轻弹混匀
➤样本要求：避免溶血（血红蛋白>0.2mg/ml会抑制HRP活性）、脂血（脂质影响光吸收值）及反复冻融
含NaN3样本需透析去除（NaN3抑制HRP活性）
| 洗板方式 |
操作要点 |
| 手动洗板 |
- 拍板力度：垂直甩干，力度以孔内无明显液滴残留为度 |
| - 浸泡时间：每次30秒 |
| - 洗涤次数：按说明书要求（通常3-5次） |
| 自动洗板 |
- 定期检查洗液针通畅性 |
| - 设置注液量≥300μl/孔 |
| - 校准吸液残量≤5μl |
● 阳性孔出现明显梯度蓝色时（通常前3-4孔）立即终止
● 终止液（2M H₂SO₄）加入顺序与显色液一致
➤波长选择：双波长检测（主波长450nm，参比波长630nm）
| 现象 |
可能原因 |
解决方案 |
| 标准曲线线性差 |
稀释误差/酶标板边缘效应 |
采用八连排枪稀释，板孔随机排列 |
| 背景值过高 |
洗板不彻底/封闭不充分 |
增加洗涤次数，优化封闭条件 |
| 复孔CV值>15% |
加样手法不一致 |
培训标准化移液操作 |
● 检测指标：TRH、TSH、甲状腺激素（T4/T3）、CRH-ACTH-CORT轴
● 技术难点：激素类小分子需采用竞争法，注意避免交叉反应
➤肿瘤免疫微环境分析（PMID:37329188）
● 检测指标：M2型巨噬细胞标记物（Arg1、CCL-22等）
● 关键控制：细胞培养上清需12000g离心去除碎片
通过系统掌握ELISA技术原理与标准化操作规范，研究人员可精准检测从pg级细胞因子到复杂血清抗体谱的各种生物标志物，为生物医学研究提供可靠的技术支撑。
ELISA技术的精准实施，离不开高质量的试剂体系与规范化的操作流程。华美生物深耕免疫检测领域多年，推出覆盖20多个物种、4000+ELISA试剂盒，涵盖神经内分泌、肿瘤免疫、感染免疫等热门研究方向，产品性能经26000+文献引用验证，灵敏度可达pg级，批内/批间差异严格控制在10%以内。
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