2020版《中国药典》于同年4月发布，其中第三部的通则和指导原则章节中，生物测定法修订了3429免疫化学法，在非标记免疫化学法中增加了表面等离子共振法（SPR， Surface Plasmon Resonance），本文主要介绍药典中关于该技术的相关内容，以及在免疫分析中的一些思考。


药典中免疫化学法的界定
免疫化学法是利用抗原、抗体在适宜条件下发生特异性、可逆性和非共价结合形成抗原-抗体复合物的原理，采用不同技术对抗原或抗体待测物进行定性、定量或定位检测的一种分析方法。该法可广泛用于生物原料药或制剂的鉴别试验、纯度与杂质分析、含量或生物活性/效价测定及稳定性等质量属性的监测。

根据对抗原或抗体是否进行标记，免疫化学法可分为标记免疫化学法和非标记免疫化学法。标记免疫化学法可采用酶、荧光基团、发光基团或放射性核素等作为标记物，常见方法有酶联免疫吸附法、免疫印迹法、免疫光分析法、发光免疫分析法、放射免疫分析法等。非标记免疫化学法常见方法有免疫沉淀法、免疫电泳法、凝集反应等。

表面等离子共振法
表面等离子共振法（SPR）系一种通过实时测定液相和固相界面上抗原-抗体复合物形成时偏振光共振角的变化来定量供试品中待测物的方法。本法无需标记，常用于检测生物分子间相互作用的特异性和亲和力大小及定量检测供试品中待测物的浓度。



表面等离子共振分析示意图
（引自Handbook of Immunoassay Technologies, 2018）


1. 对仪器的一般要求
所用仪器为表面等离子共振仪，主要由光路系统、光学检测器、液流系统、传感器芯片和含有仪器控制及数据收集处理软件的计算机系统组成。传感器芯片主要是作为固相界面偶联不同的多聚物以形成不同的表面环境，用于捕获液流系统中的待测物分子，可根据待测物分子的特性选择适宜的传感器芯片。传感器芯片表面可通过再生重复使用，若待测物或形成的复合物很容易被缓冲液洗去，则芯片表面不需进行再生，应根据芯片上生物分子与待测物分子结合反应的特性、实验的目的和表面等离子共振仪液流系统的材质等选择合适的再生缓冲液和再生条件。

2. 测定法
按各品种或通则项下的规定或仪器使用说明书操作，操作步骤一般如下。
（1）供试品溶液和缓冲液的制备
按各品种或通则项下的规定制备供试品溶液、流动缓冲液和再生缓冲液。供试品中的不溶性颗粒物可采用离心法或低蛋白吸附过滤法等去除，流动缓冲液使用前应滤过并脱气，可通过调整其 pH 值、离子强度或其他条件减少非特异性结合。再生缓冲液需根据表面等离子共振仪液流系统的材质来进行选择。

（2）传感器芯片表面的制备
传感器芯片表面的制备为SPR的核心步骤，通常是将特异性配体生物分子直接或间接地固定在传感器芯片表面的过程，使用的生物分子应具有较高的纯度。试验中既可使用预制的芯片表面，也可按仪器或芯片说明书自制芯片表面。

（3）信号检测
试验中应设置适宜的对照，并对基线、液流系统的流速和分析时间等测定参数进行设置和操作。

（4）数据分析
检测结束后，由计算机系统的分析软件获得不同溶液的传感图。供试品溶液的传感图应以流动缓冲液或对照的传感图为空白进行扣除，再将基线调零后进行分析。应根据不同检测目的选择适宜的数据分析方法。

关于SPR在免疫分析中的一些思考
首先，该技术目前广泛应用于药物开发等诸多领域，如生物分子间的亲和力和动力学测定、结合特异性分析、表位分析和作图、活性浓度检测等，SPR已成为生命科学研究领域不可或缺的研究工具。

其次，正如药典中提到的，在仪器平台相对稳定的情况下，传感器芯片表面的制备和检测分析方案的开发和验证成为了采用SPR技术开展免疫分析的核心点。通常在方法开发阶段，需要采用不同的实验设计（DOE）评估不同因素之间的作用以及对结果的影响，对于分析结果的有效性判定是必然面对的挑战。在基于特异性分子互作分析的SPR技术中尤为重要，非特异的反应存在对每一个具体项目分析结果的显著影响，所以识别SPR分析过程中的关键试剂成为了该方法建立的重点。在自检分析方案中，抗原抗体的选择至关重要，直接决定了检测方法的特异性、灵敏度以及亲和力表征的各项参数，同时对于检测浓度、稀释液及解离液的选择优化、不同试剂批次见的差异分析中，均需要积累数据以进一步标准化。

再次，采用SPR技术建立的分析方法，基本上属于自建方法，其验证至关重要，需要系统地拟定方案步骤及接受准则，分析方法的预期用途直接决定了验证的各项指标。对于SPR分析过程的关键参数和标准样品的系统建立也是企业内控的核心工作。

最后，通过SPR技术的建立和引入，无论在生物原材料的研究发现上，还是在已知具有明确相互作用关系的抗原抗体的监测分析中，均会有重要的作用，进一步弥补了普通免疫分析的不足，为高品质生物制品的开发和供应提供支持。

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