DNA聚合酶是PCR反应中的核心，最初在水生栖热菌中提取出的Taq酶逐渐满足不了扩增需求。随着应用领域的扩大，市场对DNA聚合酶的保真性、特异性、灵敏性都提出了更严苛的要求，而高保真酶的出现恰恰满足了人们的需求。下面小编将为大家简要介绍一下关于高保真酶的那点事儿。

高保真酶也是Taq酶的一种，它的独特之处就在于具有校读功能。保真酶要同时具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'核酸外切酶活性（即校正功能），因此在PCR中可纠正错误掺入的碱基，提高复制的准确性。当普通Taq酶错配率较高，不适用于长片段扩增、基因突变研究、测序等高度精确的试验需求时，我们就需要一款可靠的高保真酶帮助我们完成试验。



高保真酶的历史发展

最早纯化出保真酶并商品化的是美国NEB公司的Vent和美国Stratagene公司的Pfu。1991年，美国NEB公司在Thermococcus litoralis（热球菌属）菌株上纯化出了Tli酶—VENT保真酶。原始的Vent酶效果并不理想，保真性非常有限。后来，在Pyrococcus Strain GB-D（火球菌属）菌株上纯化出了Deep Vent保真酶，就是后来Q5的前身（Vent和Deep Vent来源两个不同的菌株）。同年，美国Stratagene公司的一名研发工程师Kelly S. Lundberg和美国乔治亚大学的研究团队从Pyrococcus furiosus菌株（火球菌属：激烈火球菌）纯化出一种DNA聚合酶，即Pfu。在95°C下，Pfu聚合酶的稳定性能比Taq聚合酶高20倍。Stratagene公司相继推出了PfuUltra和PfuTurbo系列保真酶。2007年，Stratagene被安捷伦（Agilent）收购。1995年，芬兰的生物公司Finnzymes通过一个DNA结合域融合到一个Pyrococcus-like校正聚合酶，改造成了全新的保真酶，并取名“phusion”，并申请了专利。（pfu和Deep Vent的结合体）phusion保真酶的出现让世人眼前一亮，出色的性能受到很多人的欢迎，以至于连NEB公司都改生产phusion。2010年，Thermo Fisher收购了Finnzymes。TOYOBO和TAKARA同时发起追赶，其类型不同于Pfu，以KOD著名。1997年，日本大阪大学的教授Masahiro Takagi在日本鹿儿岛市十岛村海底热泉中发现了超嗜热古菌Thermococcus kodakaraensis KOD1（热球菌属），从中分离出了KOD酶。同年，TAKARA在日本本土的海底热泉Thermococcus sp. KS-1菌株（也是热球菌属）上纯化出保真酶，就是经改造后命名的PrimeStar。

DNA 聚合酶的两大分类 
目前发现的耐热DNA聚合酶均属于A群或B群。属于A群的都来源于真细菌，如来源于栖热属的Taq、Tth、Tca、Tfl、Tfi以及来源于芽胞菌属的Bst;属于B群的耐热DNA聚合酶均来源于古细菌，如来源于高温球菌属的Tli 、焦热球菌属的Pfu和KOD1 、硫叶菌属的Sac和Sso等，大量来自B群的DNA聚合酶被称为a-like DNA聚合酶，因为它们都具有一个保守的真核a-DNA聚合酶氨基酸序列，这些DNA聚合酶都已经广泛应用于PCR技术中。 国内高保真DNA聚合酶品牌大部分都是在Pfu的基础上改造获得的，他们都属于B类DNA聚合酶。

Sso7d结合蛋白 
Sso7d是来源于Sulfolobus solfataricus的一种双链DNA结合蛋白，与DNA聚合酶融合后，聚合酶的进行性得到了显著的提升，而其对聚合酶催化活性和热稳定性没有影响。Sso7d蛋白融合到保真酶上后，有很大的提升效果。


Sso7d结合蛋白

保真度的检测 
DNA聚合酶的保真度检测方法多种多样，如菌落筛选测定、Sanger测序和三代测序（SMRT）。DNA聚合酶的保真度常用错误率的倒数表示（保真度=1/错误率），指发生错配的核苷酸数与聚合的总核苷酸数的比值。因此，DNA聚合酶保真度高度依赖于PCR扩增子长度和PCR扩增循环数。为了准确对比不同聚合酶的保真度，必须使用相同的方法和循环参数进行检测。通常，保真度表示为与Taq DNA 聚合酶保真度的相对值。



哪些因素影响了高保真DNA聚合酶的保真度？
高保真DNA聚合酶的保真度是指准确复制目的模板的结果。具体来说，这涉及到多个步骤，包括读取模板链，选择正确的三磷酸核苷，并将此核苷酸插入3’引物末端的能力。为了区分正确和错误的核苷酸，一些DNA聚合酶具有3’到5’核酸外切酶活性。这种“校正”活性可切除不正确掺入的单核苷酸，并将其替换成正确的核苷酸。高保真PCR使用掺入错误率低且具有校正活性的DNA聚合酶，以保证目的DNA的忠实复制。
在设计PCR实验时，你首先要考虑你的应用是否需要高保真聚合酶。如果实验结果依赖于正确的DNA序列（如克隆或测序），那么你就要尽量减少错配核苷酸的掺入。而对于普通PCR或菌落PCR，确定扩增子是否存在或质粒上是否带有插入片段，那高保真则大可不必。
关于DNA聚合酶的高保真，目前还没有统一的定义。人们往往与TaqDNA聚合酶比较，来判断保真度的相对高低。就是上面所说的保真度表示为与Taq DNA 聚合酶保真度的相对值。例如，NEB（NewEnglandBiolabs）的科学家测定Taq聚合酶的错误率为2.7x10-4±0.8x10-4，或每3700个碱基1个错误。这些数据表明，利用Taq以25个PCR循环扩增400bp的片段，可能一半的克隆都带有错误。对于较大的片段如1kb，每个克隆都可能带有不想要的突变。相比之下，高保真聚合酶的错误率比Taq低100倍。

高保真酶的选择 
扩增速率：合成能力是评估高保真DNA聚合酶非常重要的因素。原始的高保真DNA聚合酶因为具有较强的3'→5'外切酶活性，其合成能力较低。例如Pfu DNA聚合酶的合成速率还不到Taq DNA聚合酶的一半。
特异性：PCR扩增由低温上升至高温的过程中，酶的弱活性极易造成错配或形成引物二聚体，这种非特异性扩增会显著降低产物质量。为了减少这种现象的发生，可以人为的在开始延伸之前不让酶发挥活性，以保证扩增的特异性，这种方式也被形容为酶的热启动。
是否耐U：Pfu校正DNA聚合酶不能兼容dUTP，需要经过特殊改造后方可耐受尿嘧啶，然后才能应用甲基化文库构建或者定点突变等。
对于测序、基因功能研究、蛋白表达、定点突变等不同的应用，选择一款合适的高保真DNA聚合酶产品是极为必要的。我司有多款表现稳定的高保真DNA聚合酶，客户可根据需求自行选择合适的高保真酶进行测试。

订购信息
HiFi高保真DNA聚合酶 （HiFi DNA Polymerase）/ CSB-DEM042
KOD DNA聚合酶（KOD DNA Polymerase）/ CSB-DEM034
Pfu Ⅱ高保真DNA聚合酶（Pfu Ⅱ high fidelity DNA polymerase）/ CSB-DEM043
HiFi PCR 试剂盒（HiFi PCR Kit）/ CSB-DKT039

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