我们在进行核酸扩增时，往往会出现一些异常问题，本文主要对PCR实验中常见问题进行分析汇总，帮助理解这些问题产生的原因，从而消除疑问，得到更好的PCR实验结果，希望会对大家有所帮助。以下分别对荧光定量PCR和普通PCR进行分析。

荧光定量PCR 

1.无Ct值出现
如果遇到无Ct值情况，就需要排查是否有以下问题：
（1）循环数不够。
（2）检测荧光信号的步骤有误。
（3）引物或探针降解。
（4）模板可能降解或上样量不足。
（5）引物探针不合适。

2.Ct值出现过晚
在荧光定量PCR中，低拷贝数的样品，Ct值会增大，但一般不超过40循环，否则定量不准确。因此，判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况，需要根据具体实验设计进行分析：
（1）扩增效率低。
（2）PCR程序不合适。
（3）MgCl2浓度不合适。
（4）PCR产物太长。
（5）加样量的不足或模板中存在抑制物。

3.标准曲线线性关系不佳
如果标准曲线线性关系不佳（R2<0.9）的情况，那么有可能是存在以下问题：
（1）标准品稀释或者加样存在误差，吸样不准，使得标准品不呈梯度。（2）标准品出现降解。
（3）引物或探针不佳。
（4）模板中存在抑制物或模板浓度过高。

4.阴性对照扩增有信号
如果阴性对照扩增有信号，首先排查各操作环节是否有不当，造成交叉污染：
（1）引物设计不够优化。
（2）引物浓度不佳。
（3）镁离子浓度过高。
（4）模板有基因组的污染。
（5）交叉污染。

5.熔解曲线峰不特异
如果熔解曲线峰不特异，那么很有可能是以下环节存在问题：
（1）引物设计不够优化。
（2）引物浓度不佳。
（3）镁离子浓度过高。
（4）模板有基因组污染。

6.扩增效率低
该情况适用于针对所有的基因，特别是内参基因仍无法获得较好的扩增信号时，应考虑如下情况：
（1）反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解.
（2）反应条件不够优化。
（3）反应体系中有PCR反应抑制物。

7.重复性很差
（1）移液枪不准，加样不准确
（2）定量PCR仪在不同位置温度不一样
（3）qPCR预混液未混合均匀

8.扩增曲线的异常
如果遇到扩增曲线异常，比如扩增曲线骤降、“S”型曲线等情况，那么有可能是以下环节存在问题：
（1）模板的浓度太高或者降解。
（2）荧光染料的降解。
（3）PCR管不洁净。
（4）液体挥发。
（5）气泡。
（6）基线设置不当。
（7）扩增曲线呈锯齿状且不连续，需校正参比染料。
（8）耗材及仪器配件是否匹配
（9）仪器不稳定导致（停电或者电压亦或是发射光源不稳定）

9.同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？
判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性。如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析


普通PCR 

1.完全没有条带
（1）确认试剂是否存在质量问题或者加样时出错，导致反应体系不完整。
（2）检查模板DNA是否正确或者存在特殊结构，导致模板与引物无法结合。
（3）引物或反应温度设计不合理。

2.有很多非特异性条带
（1）反应体系被污染。
（2）引物特异性差。
（3）退火温度不合适。

3.目的条带弱
（1）聚合酶活性过低。
（2）循环次数偏低。
（3）模板DNA浓度过低。

4.PCR产物电泳条带拖尾、弥散
可能的原因和对应的解决方案如下：
（1）酶量过高或质量差。
（2）dNTP浓度过高。
（3）MgCl₂浓度过高。
（4）模板量过多。质粒 DNA 的用量应<50 ng，而基因组 DNA 则应<200 ng。
（5）引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复 PCR 反应。
（6）循环次数过多。
（7）退火温度过低。
（8）电泳体系有问题：
①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；
②凝胶没有凝固好；
③琼脂糖质量差。

5.电泳什么条带都没有
可能的原因：
（1）电极插反了
（2）没有加DNA染色剂

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