2014年MikiYamaguchi等人通过基因重组技术生产的一种重组蛋白，主要用于体外检测癌细胞对mAb的内化效率，进而筛选出更有效的单克隆抗体。该蛋白包括一个没有受体结合域的白喉毒素diphtheria toxin (DT)和链球菌蛋白G（Streptococcus protein G）的C1、C2、C3 (3C)结构域，即DT3C。DT3C是继Mab-ZAP之后检测细胞内化mAb效率的有效工具，文献数据显示，与mAb-Mab-ZAP相比，mAb-DT3C模拟的抗体偶联药物( Antibody-Drug Conjugate，ADC)具有易制备、分子量稳定及抗体内化效率高等特点^[1]。为了进一步验证DT3C在ADC抗体药内化效率检测中的作用，2015年，MikiYamaguchi等人又利用DT3C作为工具筛选了一种靶向胰腺导管腺癌细胞的anti-Mucin 13单克隆抗体^[2]。据不完全统计，目前DT3C作为检测mAb内化能力的工具已经用于近130项ADC药物mAb筛选专利中，那DT3C究竟是如何介导ADC药物mAb内化效率检测的呢？
 

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1、什么是ADC药物内化？

在细说DT3C是如何介导ADC药物mAb内化效率检测之前，我们先来了解下什么是ADC药物mAb内化。ADC药物由抗体、连接子和小分子毒素组成，是通过连接子（linker）将具有生物活性的小分子药物偶联至单克隆抗体上。单抗通过肿瘤细胞相关抗原的特异性和靶向性定位到肿瘤细胞表面，并通过内吞/内化作用进入细胞，连接子在细胞内低pH值或溶酶体蛋白作用下断裂，释放出具有活性的细胞毒药物，破坏DNA或阻止肿瘤细胞分裂，从而对肿瘤细胞起到杀伤作用。该类药物利用抗体的特异性靶向运输药物分子到靶组织发挥作用，将细胞毒药物强大的细胞杀伤能力集中于肿瘤细胞，降低对正常组织的毒副作用。在ADC设计研发过程中，首要的是药物靶点的选择。对于药物靶点的选择，除了要在肿瘤过度表达外，另一个重要因素是内吞/内化的效率，这是药物释放活性所必需的。抗体能否被内化主要由靶点决定，而抗体内化的效率则与抗原密度、抗体亲和力以及抗体与抗原结合表位密切相关。同一靶点的不同抗体也会表现出不同的内化效率。
 

2、DT3C如何介导ADC抗体药物内化效率体外检测？

如前所述，ADC药物中抗体能否被内化是药物效果评价的重要因素。这里你可能会疑问，ADC药物中抗体的内化与单纯的抗体药物内化有区别吗？为什么DT3C是专门针对的ADC药物呢？首先，ADC药物中抗体的内化与单纯的抗体药物内化肯定是有区别，首先ADC药物的分子量是大于单纯的抗体药物的，相同条件下，二者的内化效率肯定是不一样的。其次，DT3C替代的是ADC药物分子中的小分子药物，是一种免疫毒素，mAb-DT3C偶联物模拟的是ADC药物。如下图所示：mAb-DT3C偶联复合物识别并结合细胞表面抗原后，mAb-DT3C-抗原复合物被内化；然后DT3C被胞质弗林蛋白酶（furin protease）切割，DT3C的催化结构域被释放到细胞质中。DT3C的催化结构域导致延伸因子(EF)-2的 ADP-核糖基化，随后通过抑制蛋白质翻译机制导致细胞毒性。

图1. Mechanism of antibody:DT3C-induced cytotoxicity
 

作为ADC药物抗体内化检测工具，DT3C优势可总结为以下三点：

第一，mAb-DT3C偶联物制备简单，仅在室温下孵育30min就能形成，而且在体外可以发挥患者给ADC药物后的功能；

第二，DT3C可与来自不同物种（如人、小鼠、兔、山羊）的任何 IgG 结合，形成 mAb-DT3C 偶联物，从而进一步扩大了DT3C作为mAb抗体内化检测工具的范围；

第三，只有当偶联物被靶细胞内化时，mAb-DT3C 偶联物才会显着降低细胞活力。

值得一提的是，在DT3C之前，Mab-ZAP是唯.一能够检测细胞内化mAb 效率工具。 Mab-ZAP由小鼠抗体和核糖体失活蛋白皂草素组成。当 mAb-Mab-ZAP 偶联物被细胞内化时，由于皂草素的毒性，细胞会发生凋亡。所以可以通过细胞的存活率来检测mAb是否被细胞内化。但是，不能排除Mab-ZAP本身在一定程度上可能降低mAb内化效率，因为 Mab-ZAP是一种包含抗小鼠抗体的大分子。与Mab-ZAP相比，mAb-DT3C偶联物的分子量稳定且小于mAb-Mab-ZAP。并且，相关实验数据表明，mAb-DT3C内化效率高于mAb-Mab-ZAP。

 

3、ADC药物内化途径

目前，关于mAb-DT3C复合物内化的具体途径暂无相关文献报道。结合常规的ADC药物内化途径，一般来说，内化又称为内吞，正常的内吞作用可分为三个阶段：芽的形成、膜的弯曲和囊泡的成熟和膜的断裂并释放到细胞质中。ADC药物内化途径可按是否依赖于网格蛋白分为：网格蛋白介导的内吞作用和非网格蛋白介导的内吞作用。非网格蛋白介导的内吞作用又可进一步分为：小窝介导的内吞作用、小窝蛋白非依赖性载体蛋白/GPI-富集的早期内区室（CLIC/GEEC）和巨胞饮作用。多种内吞途径有重叠的方面，因此内吞的过程一般是高度灵活和复杂的。这里以小窝介导的内吞作用为例：

网格蛋白介导的内吞作用（CME）包括几个连续和部分重叠的步骤。对于质膜上的一些受体而言，CME可以组成型发生；其他受体则需要配体或抗体结合后启动。当细胞质中的内吞衣壳蛋白开始聚集在质膜的内小叶上时，CME就开始了。衣壳蛋白通过从细胞质中招募并与额外的蛋白质接头并相互作用，继续组装和生长。关键的衔接蛋白使膜弯曲，从而将内化受体/配体集中到一个“网格蛋白包被坑”（CCP）中。在CCP颈部因CCP内陷变大而收缩的点处会通过断裂与质膜分离。肌动蛋白聚合有助于将CCP “向内”拉入细胞质，直到完全分裂，CCP 被释放并变成网格蛋白包被的囊泡 (CCV)。最后，CCV外壳解体，CCV与内体融合，分拣到确定的亚细胞位置，或者可以循环回细胞表面 ^[3]。
 

参考文献：

[1] Yamaguchi M, Nishii Y, Nakamura K, et al. Development of a sensitive screening method for selecting monoclonal antibodies to be internalized by cells [J]. Biochem Biophys Res Commun. 2014: 454(4):600-3.

[2] Nishii Y, Yamaguchi M, Kimura Y, et al. A newly developed anti-Mucin 13 monoclonal antibody targets pancreatic ductal adenocarcinoma cells [J]. Int J Oncol. 2015, 46(4):1781-7.

[3] Hammood M, Craig AW, Leyton JV. Impact of Endocytosis Mechanisms for the Receptors Targeted by the Currently Approved Antibody-Drug Conjugates (ADCs)-A Necessity for Future ADC Research and Development [J]. Pharmaceuticals (Basel). 2021 Jul 15;14(7):674.