【技术帖】| 免疫组化成功指南（IHC）&常见问题汇总

确定抗体信息无误，并准备好所需样本切片后，将切片依次放到染色架上，置于200ml，2%的APES-丙酮溶液中1min，立即放入烘箱中60℃，15min，避免脱片。
➥ 脱蜡水化
从烘箱中取出染色架，放入染色盒中脱蜡。

（注：脱蜡时长随温度和脱蜡剂使用次数而定，30min~1h）

将经过脱蜡的染色架取出，沥干，依次放入无水乙醇的染色盒中。
放入3%的H₂O₂中3min，以消除组织内源性过氧化物酶的活性。
放入pH7.4的PBS中静置。
➥高压抗原修复
高压锅中水浴至100℃，并将染色架放入其中。

（注：缓冲液加热过程中为防止烧杯中进入大量水蒸汽，需将烧杯口用保鲜膜封住）

➥ 封闭
用10%非免疫山羊血清封闭切片上的组织，置于湿盒中室温静置30min。
➥一抗孵育

将封闭液甩去，加入用1%酪蛋白稀释的一抗，4℃过夜。
将切片置于染色架中，放入PBST中洗涤四次。
➥ 二抗孵育 

切片上加入酪蛋白稀释的二抗置于湿盒中37℃孵育1h。
将切片置于染色架中，放入PBST中洗涤四次。
➥三抗孵育

切片的组织上加入酪蛋白稀释的三抗置于湿盒中37℃孵育1h。
将切片置于染色架中，放入PBST中洗涤三次。再放入PBS中洗涤二次。
➥DAB染色
切片的组织上加入DAB染色液，置于湿盒中室温放置10-15 min。

（注意显微镜下观察切片染色情况，染色到深黄且背景无明显着色可进行下一步）
将切片置于染色架中，放入PBS中洗涤二次，每次5min。
➥ 苏木素染色
切片的组织上加入苏木素染色液，置于湿盒中室温放置30min。
➥ 脱水封片
将染色架置于清水中洗涤浸泡30min，放入烘箱中烤干。
切片的组织上加入中性树胶，并加上盖玻片。 
➥ 显微镜观察并拍照
选取合适视野进行拍照。

华美IHC验证图示例

明明白白做实验

善其事前利其器

普通问题常规避

优化成功没问题

 

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